Методы выявления Fusarium
Выделение грибов рода Fusarium, как правило, проводится из зараженного зерна при использовании метода "влажных камер". Для этого образцы зерна отмывают проточной водопроводной водой, обеззараживают 0,5% раствором перманганата калия, промывают стерильной водопроводной и дистиллированной водой, после чего асептически переносят в чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу. Активирование спор фузарий осуществляется при температуре 28 °С до появления на поверхности зерен видимого мицелия. Далее зерна переносят на плотную питательную среду Чапека с гентамицином, который добавляют для подавления роста сопутствующей бактериальной биоты, и культивируют при температуре 28 °С в течение 5-7 суток. Чистые культуры изолятов получают путем серийных пересевов на такую же агаризованную среду Чапека с гентамицином. Интервал между пересевами устанавливают 20-28 суток. Для определения пищевых потребностей и радиальной скорости роста фузарий используют синтетические (среда Чапека), специализированную синтетическую среду (Spezieller Nahrstoffarmer Agar) и полусинтетическую (картофельно-глюкозный агар) среды. Источник: med-microbiology.com
Химический состав сред очень важен при культивировании фузариевых грибов, поскольку влияет на культурально-морфологические характеристики (в частности форму конидий, развитие типа спороношения, синтез пигментов, образование вариантов). Учитывая это, в исследованиях в основном используют картофельный отвар и питательные субстраты на его основе, а для оценки микроморфологических признаков такие плотные питательные среды, на которых грибы формируют слабо развитый, паутинчатоподобный, бесцветный, стелющийся по поверхности мицелий, морфологические особенности которого (размеры, форма конидиеносцев, микро- и макроконидий, хламидоспоры, а также способы их формирования) легко определяются.
Кроме идентификации по морфологическим признакам, проводят молекулярно-генетические исследования. Для идентификации исследуемого штамма к определенному виду рода Fusarium амплифицируют и секвенируют (определяют нуклеотидную последовательность) один или более генов. Чаще всего секвенируют однокопийные гены, такие как β-тубулин, гистон H3, фактор элонгации трансляции TEF-1α, кальмодулин, а также рДНК, нитратредуктазу и фосфатпермеазу. Полученную последовательность сравнивают с сиквенсами родственных видов из соответствующих баз данных, например, GenBank или FUSARIUM-ID. Диагностическая ценность одного сиквенса часто недостаточна, но сиквенс нескольких генов, с учетом морфологических признаков и определением филогении, позволяет более надежно идентифицировать исследуемый штамм рода Fusarium.
Другие молекулярные методы, используемые для идентификации видов рода Fusarium, включают анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов, случайно амплифицированных фрагментов ДНК, а также определение группы вегетативной совместимости исследуемых изолятов. Все чаще используют для специфического выявления и количественного определения видов рода Fusarium в зерновых ПЦР в реальном времени.